A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋简介
背景：迄今恰巧肆虐世界的新型冠状大肠杆菌伤寒 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和地区大风靡，截至 2021 年 4 年初已导致少于 1.28 亿人大肠杆菌感染，少于 280 上千人失踪。也就是说，尚待可直接减小 COVID-19 细菌性的用药方法有。我们科学研究了一种传统文化的里面药口服药剂——祛肺毒口服液 (RDS) 的潜在促冠状大肠杆菌活命性，该口服液主要组分为新月病理学传统文化里面用做用药肺部哮喘的里面医。
结果：RDS 诱发 SARS-CoV 快大肠杆菌、SARS-CoV-2 快大肠杆菌、混搭亚型大肠杆菌-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型大肠杆菌以及传染性 SARS-CoV-2 和则有的 Ha-CoV-2 变种大肠杆菌 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对其内时会的大肠杆菌感染。我们全面事实断言 RDS 可以如此一来灭活命 SARS-CoV-2 大肠杆菌固体的传染性。此外，我们发掘出 RDS 还可切断亚型肺炎大肠杆菌对其内时会的大肠杆菌感染。
结论：RDS 可广泛应用诱发呼独脚道大肠杆菌大肠杆菌感染。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状大肠杆菌，促大肠杆菌用药，祛肺毒口服液，传统文化里面药，SARS-CoV，亚型肺炎，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型大肠杆菌
▋背景
迄今恰巧肆虐世界的新型冠状大肠杆菌伤寒 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家和地区大风靡，截至 2021 年 4 年初已导致少于 1.28 亿人大肠杆菌感染，少于 280 上千人失踪。也就是说，尚待可直接减小 COVID-19 细菌性的用药方法有。新不止现的 COVID-19 大肠杆菌伤寒原体为冠状大肠杆菌 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在导致急性呼独脚囊肿特别冠状大肠杆菌种类里面的姊妹大肠杆菌[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在里面国发掘出的；SARS-CoV 大肠杆菌于 2002 年 11 年初在广东省首次被发掘出[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年初在武汉首次被发掘出[1,7,8]。在里面国，这两次由冠状大肠杆菌引起的霍乱里面，里面药均被广泛应用用到，用以先行应对冠状大肠杆菌引起的哮喘。对于也就是说的 COVID-19 大风靡，里面国有少于 85% 的 SARS-CoV-2 大肠杆菌感染患者不能接受了传统文化里面医药临床（9，10）。许多用到的里面药是否是具备直接的促冠状大肠杆菌特性并在临床上是否是直接，这个极其重要问题没赢取充分答复。
里面药作为用药冠状大肠杆菌所引发哮喘的直接临床，但由于不够体内或肾脏的该系统科学研究，其发展与合理用到均受到了促使。为了断定里面药的潜在促 SARS-CoV-2 活命性，我们从常用里面药里面挑选不止了多种药材水杨酸，并从里面药口服液 RDS(澳大利亚一种娱乐业性食品药品) 里面发掘出了促 SARS-CoV 和促 SARS-CoV-2 大肠杆菌的活命性，一种在澳大利亚的娱乐业食品药品。RDS 用做强化生理呼独脚该系统的总体健康，其包内含多种药材组分，如肉桂和荆芥，它们是传统文化上用做操控坏死和肺部哮喘的里面医 (11-13)。在此，我们另据 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假大肠杆菌以及具备大肠杆菌脑膜炎的野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌对其内时会的大肠杆菌感染具备促菌。我们全面断言 RDS 可通过如此一来灭活命大肠杆菌固体或企左图大肠杆菌侵占而诱发大肠杆菌的一时期大肠杆菌感染进度。此外，我们发掘出 RDS 还可以企左图甲流大肠杆菌对其内时会的大肠杆菌感染。这些相比较，RDS 对呼独脚道大肠杆菌的大肠杆菌感染可能具备广泛应用的促菌。
▋结果
为了从传统文化里面医里面见到潜在的促 SARS-CoV-2 活命性，我们从约四十种传统文化药材里面挑选不止浓缩不止 SARS-CoV-2S 受体假型快大肠杆菌[14,15] 和生理肺部 A549(ACE2) 其内时会，此人类 ACE2 基因时会通过快大肠杆菌转导作为表现形式依赖性，从而稳定转导来实现超解读。快假型大肠杆菌用到绿色荧光受体 (GFP) 或荧光素在酶 (Luc) 作为另据基因，并通过了具备广谱促大肠杆菌进入诱发剂，以及阿比阿克 (Arbidol)[16]，和人类促毒血清对促 SARS-CoV-2(左图 1a、C) 的验证。我们能够取得成功检测到阿比阿克 (Arbidol) 和促毒血清对于 SARS-CoV-2 假型大肠杆菌的促菌，这是我们在其他四十余种传统文化药材水杨酸测试里面从没发掘出的，还包括其里面一些总计存较高疗效的药材 (左图 1a-C)。然而，鉴于快性假型大肠杆菌非常少能检测 SARS-CoV-2 大肠杆菌的侵占行为，我们不能排除这些药材水杨酸可能有在进入后阶段能够诱发 SARS-CoV-2 的可能性。我们全面从传统文化药物祛肺毒口服液 (RDS) 里面挑选不止不止了可能的促 SARS-CoV-2 活命性，该电子产品带有都可药材组分——、黄连、肉桂、荆芥、龙胆、苦杏仁、蜂房、皂角、醋，在里面国传统文化上用做用药肺部哮喘 (11-13)。
带有吡啶冰淇淋酸、3，4-二邻冰淇淋酰基奎宁酸、吡啶 3，4-二邻冰淇淋酰基奎宁酸、原儿茶酸、吡啶绿原酸和黄杨草素在；花蕾里面还带有苯甲酸 A、B 和 10 种目前为止环烯醚单糖苯甲酸[17]；该植物学还带有皂补血补血 A 和 B，以及促坏死作用的苯甲酸 C[18,19]。黄连酯苯甲酸里面带有木脂素在、松脂醇和黄连苯甲酸[20]。肉桂里面带有被称为肉桂皂苯甲酸的甾体皂苯甲酸，是肉桂同属植物学多种不同的植物学有机物[21,22]。细叶荆芥里面主要活命性组分为四种单单糖，(−)-薄荷苯、(+)-普博梅斯苯、(−)-柠檬烯和 (+)-薄荷丙苯；这种植物学还带有其他氟化，如 1-辛烯-3-醇、3-辛苯、β-年初桂烯和β-石竹烯[23]。龙胆带有少于 162 种氟化，还包括环烯醚单糖和环烯醚单糖苯甲酸、苯丙苯甲酸、有机酸、单小分子、小分子、姜黄、和皂苯甲酸[24]。苦杏仁里面带有酚类、氰基氟化和果胶单糖[25]。皂角刺里面带有皂苯甲酸和羽扇豆酸[26,27]，而醋里面带有主要活命性组分醋酸[28]。为了全面测试 RDS 的促 SARS-CoV-2 活命性，用并不相同溶解电导率的 RDS 预一处理模式 A549(ACE2) 细胞时会，然后让这些细胞时会在总计存 RDS 的就时会不能接受 4-6 两星期的大肠杆菌感染。大肠杆菌感染后，在不总计存 RDS 的就时会培训细胞时会，然后在 48 和 72 两星期的时候，通过流式细胞时会妖术对大肠杆菌大肠杆菌感染的促菌顺利进行定量。为了操控细胞时会疗效，用到铋丙啶 (PI) 对即将失踪和已失踪的细胞时会顺利进行染色剂，非常少在活命细胞时会群里面数据分析 GFP+细胞时会。如左图 2 下图，我们辨别到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假大肠杆菌具备浓度选择性促菌。为了得出结论这些结果，我们用到内源性解读 ACE2 的 VeroE6 细胞时会重复了该大肠杆菌感染科学实验。
(见下页左图)
ACE2 内外解读，反观 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 大肠杆菌可对其顺利进行大肠杆菌感染，ACE2 上时会用做冠状大肠杆菌的科学研究 (7)。考虑到在不够 ACE2 超解读 [15，29，30] 的就时会，假型大肠杆菌对 VeroE6 的大肠杆菌脑膜炎较低，我们还用到了荧光素在酶另据基因假型大肠杆菌，该大肠杆菌的另据基因解读由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，具备更高的另据基因持久性和数据压缩。
左图 2：RDS 诱发 SARS-CoV-2(GFP) 假型大肠杆菌大肠杆菌感染 A549(ACE2) 细胞时会。
A.A549(ACE2) 细胞时会用 RDS 月份溶解 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型大肠杆菌大肠杆菌感染。将细胞时会洗涤去大肠杆菌和 RDS，并在不总计存 RDS 的就时会顺利进行培训。流式细胞时会容检测大肠杆菌大肠杆菌感染诱发就时会。没大肠杆菌感染的细胞时会和大肠杆菌感染 SARS-CoV-2(GFP) 但没经 RDS 用药的细胞时会作为相异。GFP+细胞时会人口比例已看出。(PI) 铋丙啶。
B.RDS 的细胞时会疗效计量。A549(ACE2) 细胞时会用 RDS 月份溶解 4 两星期，洗涤去 RDS，无 RDS 培训 48 两星期。铋丙啶染色剂解剖恰巧在失踪细胞时会和已失踪细胞时会，流式细胞时会妖术数据分析。插左图浓度-反应时会细胞时会疗效斜率，RDS 的半受害电导率 (LC50) 人口比例为 1:11.9。
如左图 3A 下图，我们用到 Luc 报告基因假大肠杆菌和 VeroE6 细胞时会顺利进行大肠杆菌感染科学实验，辨别到 RDS 对该大肠杆菌大肠杆菌感染具备浓度选择性促菌，并且将近诱发电导率断定为 1:230RDS 溶解度 (左图 3B)。我们还定量了 RDS 对 VeroE6 细胞时会活命力的受到影响，断定了 50% 细胞时会失踪浓度为 1:11.8RDS 溶解度。
左图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假大肠杆菌和野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌的浓度选择性诱发促菌。用 RDS 月份溶解预一处理模式 A、BVeroE6 细胞时会，并用 SARS-CoV-2(Luc) 假型大肠杆菌大肠杆菌感染。将细胞时会洗涤去大肠杆菌和 RDS，并在不总计存 RDS 的就时会顺利进行培训。在大肠杆菌感染后 72 两星期用荧光素在酶检测大肠杆菌大肠杆菌感染的促菌。没大肠杆菌感染细胞时会和 SARS-CoV-2-luc 大肠杆菌感染但没经过 RDS 用药的细胞时会作为相异。科学实验重复三次。插左图浓度反应时会斜率和 RDS 的 I-C50 溶解人口比例为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞时会的细胞时会疗效也通过铋丙啶染色剂和流式细胞时会妖术计量。用 RDS 月份溶解 4 两星期，洗涤去 RDS，在不内含 RDS 的就时会培训 72 两星期。插左图细胞时会疗效浓度-反应时会斜率，RDS 的半受害电导率 (LC50) 人口比例为 1:13.8 溶解。DRDS 诱发传染性 SARS-CoV-2 大肠杆菌感染。用月份溶解的 RDS 预一处理模式 VeroE6 细胞时会，并在 RDS 总计存的就时会大肠杆菌感染 SARS-CoV-2。大肠杆菌感染 48 两星期后，通过噬菌斑数据分析大肠杆菌无罪释放后的大肠杆菌复制诱发就时会。诱发测试一式三份顺利进行，并在 Prism7(Graph Pad) 里面用到单向随机变量 (One-Way ANOVA) 数据分析及 Dunnett 后解剖 (Dunnett's Post Test)，便是断定人口统计显着性。特别性系数用星号透露如下：*p
为了全面验证用到假大肠杆菌获得的结果，我们测试了 RDS 对于 SARS-CoV-2 大肠杆菌感染的切断传染性潜能。如左图 3D 下图，RDS 同时也切断了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞时会的大肠杆菌感染。RDS 在溶解 1:40 以上时可显著增加大肠杆菌淡褐色的形成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假大肠杆菌与传染性大肠杆菌的相比较，RDS 带有诱发 SARS-CoV-2 大肠杆菌感染的活命性组分，可能是通过如此一来灭活命大肠杆菌或切断大肠杆菌的一时期大肠杆菌感染进度。
为全面科学研究可能的机制，我们将传染性 SARS-CoV-2 大肠杆菌固体与月份溶解的 RDS 在 37°C 下预培训 1 两星期。随后，将混搭物全面依次溶解-(10–1 至 10–4)，并延入 Vero 细胞时会顺利进行噬菌斑数据分析以断定大肠杆菌大肠杆菌脑膜炎的减小。如左图 4A 下图，我们辨别到在 RDS 里面短暂暴露一两星期后的大肠杆菌固体，其 SARS-CoV-2 的大肠杆菌感染效价也圆形浓度选择性降低。该结果得出结论了 RDS 可直接如此一来灭活命 SARS-CoV-2 大肠杆菌固体的传染性。
我们全面测试了 RDS 是否是也能诱发 SARS-CoV-2 大肠杆菌变种的大肠杆菌感染。为此，我们借助于最近合作开发的混搭甲大肠杆菌-SARS-CoV-2 假型大肠杆菌 (Ha-CoV-2)[31] 来制取一新作 S 受体类似于，还包括英国类似于 (B.1.1.7)，南非类似于 (B.1.351)，巴西类似于 (P.1)，延州类似于 (B.1.429)，和其他几个新兴类似于 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和特别 S 受体性状体在 37°C 月份溶解 RDS 培训 1 两星期。随后，用该混搭物大肠杆菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 其内时会。大肠杆菌感染后 12 两星期，荧光素在酶校准大肠杆菌大肠杆菌感染的促菌。如左图 4B 下图，我们还辨别到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 受体类似于的浓度选择性诱发。
我们还测试了 RDS 切断 SARS-CoV 大肠杆菌感染的潜能，用到带有 SARS-CoV 突刺受体的 GFP 另据基因快大肠杆菌和[15] 所谓浓度。我们将人 A549(ACE2) 细胞时会做为其内时会，将其用新作溶解的 RDS 预一处理模式，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因假大肠杆菌大肠杆菌感染 4-6 两星期。大肠杆菌感染后在不内含 RDS 的就时会培训细胞时会，流式细胞时会妖术定量检测其对大肠杆菌大肠杆菌感染的促菌。值得注意，用到铋丙啶排除恰巧在失踪与已失踪的细胞时会，非常少在活命细胞时会群里面数据分析 GFP+细胞时会。如左图 5A 下图，我们辨别到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型大肠杆菌的促菌圆形浓度选择性。我们全面得出结论了这些结果，并定量了 RDS 依赖性的诱发与 Luc 另据基因 SARS-CoV 假型大肠杆菌，SARSCoV(Luc)。我们辨别到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的促菌圆形浓度性依赖，其半诱发电导率 (IC50) 为 1:70.88 溶解度 (左图 5B，C)。考虑到 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都用到 ACE2 大肠杆菌感染其内时会，我们还测试了 RDS 的促大肠杆菌活命性是否是非常少针对与 ACE2 有相互作用的冠状大肠杆菌。为此，我们检测了一种不特别的负链 RNA 大肠杆菌--亚型肺炎大肠杆菌。它通过大肠杆菌血凝素在 (HA) 和细胞时会α-唾液酸来大肠杆菌感染其内时会。为了制取亚型肺炎大肠杆菌，将解读亚型肺炎 A/WSN/33(H1N1) 真核生物每个片段的 8 个表现形式和一个 GFP-另据基因总计转染到 HEK293T 细胞时会里面。在 RDS 总计存的就时会，搜罗大肠杆菌固体并用做大肠杆菌感染目标 MDCK 细胞时会。如左图 6A 下图，我们辨别到 RDS 对亚型肺炎大肠杆菌的促菌圆形浓度选择性。RDS 在 1:40 和 1:80 溶解时可完全切断大肠杆菌大肠杆菌感染，在 1:160 溶解时是可一小诱发亚型肺炎。RDS 对 MDCK 细胞时会的半受害电导率 (LC50) 经校准为 1:18.5(左图 6B)。这些相比较，RDS 的促大肠杆菌活命性并非针对特定大肠杆菌，而可能能够广泛应用诱发多种呼独脚道大肠杆菌，如冠状大肠杆菌和亚型肺炎大肠杆菌。
▋讨论
在本报告里面，我们事实断言传统文化药物祛肺毒口服液 (RDS) 带有广谱促大肠杆菌活命性，可切断 SARS-CoV、SARSCoV-2 和亚型肺炎大肠杆菌的大肠杆菌感染。虽然 RDS 能够诱发多种大肠杆菌，但其促大肠杆菌活命性因大肠杆菌一般来说和HIV-而异。例如，对 SARS-CoV 快假大肠杆菌的 I-C50 电导率为 1:7.9 溶解度，对 SARS-CoV-2 快假大肠杆菌的 I-C50 电导率为 1:230 溶解度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌，I-C50 为 1:40 溶解度，对亚型肺炎，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其变种有并不相同的促菌，IC50 数系数从 1:70 到 1:2601 溶解度不等 (左图 4B)。
(见下一页左图)
左图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和则有的 Ha-CoV-2 变种具备浓度选择性灭活命作用。ASARS-CoV-2 固体延月份溶解的 RDS 在 37°C 下培训 1 两星期。随后，将混搭物全面月份溶解，并延入 Vero 细胞时会里面顺利进行噬菌斑数据分析，以断定大肠杆菌大肠杆菌脑膜炎减小。诱发测试一式三份顺利进行，并在 Prism7(GraphPad) 里面用到单向随机变量 (One-WayANOVA) 数据分析和 Dunnett 后解剖 (Dunnett'sPostTest) 便是断定人口统计显着性。特别性系数用星号透露如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和特别 S 受体类似于与月份溶解的 RDS 在 37°C 培训 1 两星期后，用混搭物大肠杆菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 其内时会。大肠杆菌感染后 12 两星期，荧光素在酶校准大肠杆菌大肠杆菌感染的促菌。RDS 的 IC50 系数的溶解度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们全面事实断言 RDS 可以诱发冠状大肠杆菌的一时期大肠杆菌感染进度。虽然具体的促大肠杆菌机制没清楚，但 RDS 可以通过如此一来灭活命大肠杆菌固体或通过企左图大肠杆菌侵占或切断大肠杆菌侵占后的一时期进度来企左图大肠杆菌大肠杆菌感染。在其他几种传统文化里面药里面也发掘出了促 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活命性。例如，一种常见的传统文化里面药——醋。
醋根里面已断言带有醋酸素在，可诱发 SARS 大肠杆菌[32] 临床分离株的复制。此外，另一种可用做用药呼独脚道哮喘的里面药——双黄连药剂，已看出不止在肾脏以浓度选择性模式诱发 SARS-CoV-23CL 受体酶 (3CLpro) 活命性。悬钩子苯甲酸和悬钩子素在拟作为双黄连切断 3CLpro[33] 的直接组分。
左图 5 RDS 诱发 SARS-CoV 假型大肠杆菌对 A549(ACE2) 细胞时会的大肠杆菌感染。用月份溶解的 RDS 预一处理模式 A、B 细胞时会，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型大肠杆菌大肠杆菌感染。将细胞时会去除，去除大肠杆菌和 RDS，在不总计存 RDS 的就时会顺利进行培训。在大肠杆菌感染后 48 两星期和 72 两星期，通过流式细胞时会妖术或荧光素在酶检测来计量大肠杆菌大肠杆菌感染的促菌。科学实验重复三次。插左图浓度自发斜率，并插左图 RDS 的 IC50 系数为 1:70.9 溶解度 (C)
左图 6 RDS 诱发甲流大肠杆菌对 MDCK 细胞时会的大肠杆菌感染。(A) 用月份溶解的 RDS 预一处理模式 MDCK 细胞时会 30 分钟，然后用甲流大肠杆菌 (GFP) 对其顺利进行大肠杆菌感染。大肠杆菌感染后，在 RDS 总计存下培训细胞时会。36 两星期后用流式细胞时会容对大肠杆菌大肠杆菌感染的促菌顺利进行计量。把没大肠杆菌感染的细胞时会与被甲流大肠杆菌 (GFP) 大肠杆菌感染但没经 RDS 一处理模式的细胞时会顺利进行对比。左图里面看出了 GFP+细胞时会的人口比例。PI 透露铋丙啶 PI。
(B) 另外还用到了 MTT 校准法计量了 RDS 对 MDCK 细胞时会的疗效，插左图了细胞时会疗效的浓度-反应时会斜率，经计算，RDS 的将近受害电导率为 1:18.5 溶解度 RDS 的直接促大肠杆菌组分没断定。然而，RDS 并不相同于悬钩子苯甲酸和悬钩子素在，RDS 可以通过如此一来灭活命大肠杆菌中微子来切断大肠杆菌大肠杆菌感染 (左图 4)，而悬钩子苯甲酸和悬钩子素在则在大肠杆菌生命周期的早期通过切断大肠杆菌受体酶的活命性来发挥作用。然而，RDS 的肾脏促 SARS-CoV-2 活命性仍需在今后的哺乳动物科学研究和人类临床测试里面赢取得出结论。迄今，我们恰巧在顺利进行小型哺乳动物科学实验，以断定 RDS 在体内切断 SARS-CoV-2 大肠杆菌大肠杆菌感染的潜力。
▋结论
我们的科学研究表明，RDS 可广泛应用诱发呼独脚道大肠杆菌的大肠杆菌感染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和亚型肺炎。
▋方法有
细胞时会和细胞时会培训
HEK293T (ATCC 佩拉格鲁，弗吉尼亚) MDCK (ATCC 佩拉格鲁，弗吉尼亚)，VeroE6 (ATCC 佩拉格鲁，弗吉尼亚) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 借给，佩拉格鲁，弗吉尼亚)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 借给，佩拉格鲁，弗吉尼亚) 迄今存放于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific) 带有 10% 热灭活命 FBS 和 1×头孢菌素在-阿司匹林 (赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞时会培训基里面分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的电导率延入嘌呤霉素在和潮霉素在 B。
质粒转染和大肠杆菌制取
内含 SARS-CoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的快性假型大肠杆菌固体由 Virongy LLC (Manassas，VA) 提供者，或按照在后描述的方法有[15] 制取。简言之，为了制取 GFP 另据基因快性假大肠杆菌，HEK293T 细胞时会与解读 SARS-CoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的表现形式、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 总计转染。为了产不止荧光素在酶另据基因快性假型大肠杆菌，将 HEK293T 细胞时会与解读 SARSCoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的表现形式、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 顺利进行总计转染。转染后 48 两星期搜罗大肠杆菌上清液，离心浓缩，−80℃ 存放。野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 提供者。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因质粒和 A/WSN/1933 H1N1 则有质粒 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 博士友好提供者。在肺炎大肠杆菌 A-GFP 另据基因中微子制取里面，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 总计转染 HEK293T 细胞时会 (ΔAT6)。48 两星期后搜罗大肠杆菌上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 解读表现形式购自 Sinobiological。借助于 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 表现形式和 S 受体性状表现形式。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 受体性状中微子按照在后描述方法有[31] 顺利进行制取。
大肠杆菌大肠杆菌感染和药物诱发测试
RDS(祛肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 借给，利斯堡，弗吉尼亚) 是由白马博士科学Laboratory (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种娱乐业电子产品。RDS 里面所有里面医组分均符合《里面国食品卫生 2015 年版》「饮片」常规，还包括直接组分电导率及重金同属、农药普通版检测。RDS 是一种里面药的总计煎剂，终于产物在真空条件下溶化。SARS-CoV-2 促血清由 LanceA. Liotta 医生提供者。将阿比朵尔咪唑 (Sigma) 于是又一悬浮在二吡啶亚砜 (Sigma) 里面。对于假型大肠杆菌大肠杆菌感染，12 孔板里面的 A549(ACE2) 细胞时会 (来自 Virongy LLC 借给，佩拉格鲁，弗吉尼亚) 或 VeroE6 细胞时会用 RDS 预一处理模式 30 分钟，在 37℃ 下大肠杆菌感染 4-6 两星期，然后在新鲜培训基里面洗涤涤培训 48-72 两星期。对于 VeroE6 细胞时会的大肠杆菌感染，细胞时会也被 CoV-2 假型大肠杆菌大肠杆菌感染强化剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 借给，佩拉格鲁，弗吉尼亚) 预一处理模式后，在 37°C 下于是又一处理模式 30 分钟。用到 GloMaxDiscover 酶标容 (Promega) 数据分析细胞时会裂解物的荧光素在酶活命性。对于野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌感染，VeroE6 细胞时会在 37°C 下用 RDS 预一处理模式 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 大肠杆菌感染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在威廉里德的学校的 BSL-3 收容设施内停留 1 两星期。细胞时会用 PBS 洗涤涤 2 次，用内含 RDS 的培训基培训 48 两星期。从上清里面浓缩大肠杆菌，用 12 孔板培训的 Vero 细胞时会单层里面的噬菌斑测试校准小瓶滴度。简言之，每个探针在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 培训基 (VWR) 里面制取，包内含 1X 头孢菌素在-阿司匹林 (VWR)，并添延 10% 的 FBS(赛默飞世尔科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种溶解液溶解到 VeroE6 细胞时会单层的三个平行孔上 1 两星期。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一一小完整的 Eagle Minimal Essential 培训基 (VWR) 的混搭物构成单层，内含 1X 头孢菌素在-阿司匹林，并添延 10%FBS。48 两星期后，将单层膜固定在 10% 甲醛水溶液里面 1 两星期，并去除构成的琼脂塞。为了染色剂淡褐色，延入带有 20% 乙醇的 1% 浓缩紫染料水溶液 5 分钟，然后用去离子水洗涤涤。对于亚型肺炎大肠杆菌大肠杆菌感染 MDCK 细胞时会，在 37°C 下用 RDS 预一处理模式 30 分钟，然后用 A-GFP 另据基因大肠杆菌大肠杆菌感染 6 两星期。用内含 RDS 的培训基洗涤涤细胞时会，培训 36 两星期。GFP 解读通过流式细胞时会容计量。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 大肠杆菌固体的 RDS 灭活命测试，将 100μl 月份溶解的 RDS 添延到 1 mlSARS-CoV-2 大肠杆菌原液 (3.65×105PFU/ml) 里面，终于 RDS 溶解为 1:20，1:40 或 1:80。也还包括相异条件 (1 ml 大肠杆菌+100μl 培训基)。混搭物在 37°C 下培训 1 两星期。随后，对混搭物顺利进行新作溶解以造成了额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 溶解度，并将月份溶解的探针延入 12 孔板里面的 Vero 细胞时会里面，用做顺利进行噬菌斑校准数据分析。淡褐色校准里面终于的 RDS 溶解度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 溶解液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 受体性状中微子按照在后描述的方法有[31] 制取。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活命，将 5μl 月份溶解的 RDS 添延到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或类似于里面，终于 RDS 溶解度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将混搭物在 37°C 下培训 1 两星期，然后在 RDS 总计存下大肠杆菌感染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞时会 12 两星期。用到 GloMax Discover 酶标容 (Promega) 数据分析细胞时会裂解物的荧光素在酶活命性。
细胞时会疗效数据分析检测
用铋丙啶染色剂和流式细胞时会妖术定量对 A549 (ACE2) 细胞时会和 VeroE6 细胞时会的药物细胞时会疗效顺利进行检测，如所述 (34)。用到细胞时会增殖羰基盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商敦促的方案对 MDCK 细胞时会的药物疗效顺利进行定量。简言之，将 MDCK 细胞时会 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞时会的速度疫苗接种到 12 孔板里面。细胞时会培训隔夜后，通过 RDS 一处理模式 1 天，然后在 MTT 标示羰基 (Sigma) 的培训基里面培训。将细胞时会与标示羰基总计同培训 4 两星期，于是又近期延入 MTT 增水溶液。培训皿孵育旅店，用 GloMax Discover 酶标容 (Promega) 校准独脚光度。
缩写
SARS-CoV：导致急性呼独脚该系统囊肿特别冠状大肠杆菌；SARSCoV-2：Severe 导致急性呼独脚该系统囊肿特别冠状大肠杆菌-2；TCM：传统文化里面药；RDS：呼独脚道排毒口服液；Ha-CoV-2：混搭亚型新冠大肠杆菌假大肠杆菌。
致谢
深受感动 FengLi 提供者肺炎大肠杆菌解读表现形式，深受感动 LanceLiotta 提供者促毒血清；深受感动 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的讨论与敦促；深受感动 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 提供者 RDS 和药材水杨酸。
所写贡献
此次科学实验由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 出版人，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该科学实验。所有所写已阅读并批准终于稿件。
资金
本科学研究的经费来自于威廉里德的学校内外拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 提供者。
数据资料和材料的可用性
本科学研究里面造成了或数据分析的所有数据资料均包内含在本文里面。羰基可从 Y.W 一处借助。
声明
批准及加入同意
不适用
同意不止版
不适用
竞争商业利益
威廉里德的学校国家生物学抵御和风靡伤寒里面心的 RMH 和 YW 已获得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的科学研究资助，LAH 为德佳和畅担任顾问并获得了酬金。从没其他关系或举办活命动就时会受到影响到提交的工作。
所写除此以外
1澳大利亚弗吉尼亚威廉里德的学校该分子生物学学学院国家生物学抵御和风靡伤寒里面心，佩拉格鲁 20110。
2VirongyLLC，弗吉尼亚佩拉格鲁。3延拿大伯纳比，BCV5J0E5 白马博士科学Laboratory (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 澳大利亚弗吉尼亚利斯堡联合国大时会科学组织起来，20176。
收稿日期：2021 年 4 年初 7 日
不能接受日期：2021 年 5 年初 10 日
线上不止版整整：2021 年 5 年初 29 日
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编辑： 翟超男相关新闻
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